1440年，53位貴族和19個(gè)城市在馬林堡建立了旨在反抗騎士團(tuán)專橫統(tǒng)治的普魯士聯(lián)盟。

1453年，普魯士聯(lián)盟與波蘭結(jié)成同盟，由此引發(fā)了連續(xù)13年的戰(zhàn)爭(zhēng)，直到1466年簽訂第二次托倫和約方才結(jié)束（十三年戰(zhàn)爭(zhēng)）。這次和約使得騎士團(tuán)國(guó)又損失了大量的領(lǐng)土，其中包括馬林堡。在政治上，騎士團(tuán)國(guó)要承認(rèn)臣服于波蘭，這一條在騎士團(tuán)內(nèi)部引起了極大的爭(zhēng)議。

德意志分團(tuán)希望從神圣羅馬帝國(guó)和教廷那兒獲得支持，1494年，德意志分團(tuán)長(zhǎng)承認(rèn)臣服于神圣羅馬帝國(guó)皇帝馬克西米連一世（Maximilians I.）。

外患內(nèi)憂之下，此時(shí)的騎士團(tuán)國(guó)已經(jīng)走到山窮水盡之處。路德的宗教改革使騎士團(tuán)再一次走上歷史的分水嶺。

1511年，來自霍亨佐倫家族的年僅21歲的阿爾布雷希特（Albrecht）被選為條頓騎士團(tuán)第37任大團(tuán)長(zhǎng)，他也是作為一個(gè)軍事修會(huì)的條頓騎士團(tuán)最后一任大團(tuán)長(zhǎng)。

1520年，由于Albrecht拒絕臣服于波蘭，騎士團(tuán)國(guó)與波蘭之間爆發(fā)戰(zhàn)爭(zhēng)，騎士團(tuán)國(guó)被擊敗。郁悶之下，Albrecht回到德意志。當(dāng)時(shí)的德意志境內(nèi)正在進(jìn)行著轟轟烈烈的宗教改革，阿爾布雷希特很快被路德新教所吸引，并結(jié)識(shí)了宗教改革的發(fā)起者馬丁·路德。

在路德的建議下，阿爾布雷希特（Albrecht）辭去條頓騎士團(tuán)大團(tuán)長(zhǎng)一職，將騎士團(tuán)國(guó)世俗化，改為公國(guó)，在公國(guó)內(nèi)進(jìn)行宗教改革，對(duì)外則拒絕對(duì)波蘭的臣屬關(guān)系。

騎士團(tuán)內(nèi)部的保守勢(shì)力以及德意志的天主教貴族對(duì)于阿爾布雷希特（Albrecht）的改宗十分不滿，不過阿爾布雷希特（Albrecht）在1527年娶了北方強(qiáng)國(guó)丹麥國(guó)王腓特烈一世的女兒，反對(duì)派對(duì)他無可奈何。