萊道菲陰謀使得伊麗莎白不得不重新考慮如何處置瑪麗。1572年，議會(huì)在女王的鼓勵(lì)下，訂立了一道禁止瑪麗成為英格蘭女王的法案（即“聯(lián)合合約”），其目的在于預(yù)防任何可能在刺殺女王中得益的繼位者。這道法案并不是法令，但數(shù)以千計(jì)的人在上面簽字，包括瑪麗自己。

伊麗莎白再也不能容忍瑪麗，因?yàn)樗盏皆S多報(bào)告，有人陰謀謀害她本人而讓瑪麗取而代之（一些歷史學(xué)家認(rèn)為這些都是瑪麗的敵人偽造的）。

瑪麗斯圖亞特于1587年2月8日在北安普敦郡佛斯里亨城堡被處極刑，罪名是被懷疑卷入陰謀，貝比通陰謀，企圖刺殺伊麗莎白。行刑那天，瑪麗身著紅色，表明她是一個(gè)天主教殉教者。

行刑過(guò)程是很殘酷的，一些人事后回憶說(shuō)那天劊子手喝醉之后長(zhǎng)喘三口大氣才把瑪麗的頭砍下來(lái)，當(dāng)?shù)谝桓^下去，據(jù)傳她用喉嚨喃喃作聲說(shuō)：“劊子手，做完你的事兒！”

關(guān)于這場(chǎng)行刑有很多其他版本，但經(jīng)久不衰延續(xù)至今的版本是：當(dāng)劊子手拿著瑪麗面容冷峻的頭顱向在場(chǎng)的人展示的時(shí)候，這才發(fā)現(xiàn)瑪麗戴了一個(gè)假發(fā)頭套（戴著假發(fā)，就像她平時(shí)那樣）。她死后的面容難以辨認(rèn)。

瑪麗最初被埋葬在彼得鎮(zhèn)大教堂，但是她的遺體于1612年被她的兒子，英格蘭國(guó)王詹姆士一世挖掘出來(lái)了，遷葬到威斯敏斯特教堂。仍在那兒，她的墓穴和她表姑伊麗莎白的只有30英尺（9米）之遙。