按照常規(guī)繼承法的規(guī)定，瑪麗在其無嗣的表姐瑪麗一世（英格蘭女王瑪麗一世）之后，是英格蘭王位的下一個繼承人。根據天主教，伊麗莎白是私生女，使瑪麗成為真正的王位繼承人。

盡管反天主教嗣位法直到1701年才通過。亨利八世的意志使斯圖亞特家族仍被排除在繼承英國王位的行列裏?，旣惖穆闊┯捎诜▏裰Z派起義（稱作1560年3月6日到17日的安波依斯陰謀）而增多，使得法國不能在蘇格蘭方面救援瑪麗。繼承問題由此產生。

1560年12月5日，弗朗索瓦二世去世。她在18歲就成了寡婦。在法國有自己的封地和大筆的收入。

二、重返蘇格蘭

當時蘇格蘭的情況越來越希望瑪麗女王回到蘇格蘭，因為她的母親的去世，這個國家變得非常不穩(wěn)定、非常危險的政治局面。國家的實權操在新教徒貴族手中，他們召開非法國會以實現改革并廢除教皇的權利。

瑪麗于1561年8月19日回到了利斯，她才僅僅十八歲，盡管她很有天賦，但她的成長背景沒有給她判斷力以應付當時蘇格蘭危險復雜政治局面。宗教使得人民之間矛盾重重，瑪麗的私生兄弟，第一代莫里伯爵詹姆士·斯圖亞特，是新教派系的首領。

瑪麗作為一個虔誠的羅馬天主教徒，卻遭到了許多臣民和她父親表妹英格蘭女王伊麗莎白一世以及新教鄰國君主的猜疑。新教改革者約翰·諾克斯就公然鼓動他人反對瑪麗，指責瑪麗聽彌撒，跳舞，穿著太精細和其他東西。

一次新教徒叛亂威脅到在霍利魯特瑪麗私人教堂舉行的彌撒。這一叛亂使得天主教處于一種停頓狀態(tài)，實際上除了女王和她的家屬以外，一切彌撒都遭到禁止。